抗微生物藥物耐藥(antimicirobial resistance，AMR)是全球公共衛(wèi)生面臨的重要威脅。艱難梭菌(Clostridioides difficile，CD)是一種重要的多重耐藥菌，常對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、四環(huán)素類、頭孢菌素類和氟喹諾酮類呈多重耐藥。該特征使得CD能夠在應(yīng)用廣譜抗菌藥物導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)時(shí)進(jìn)行優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)、產(chǎn)生毒素從而造成艱難梭菌感染(Clostridioides difficile infection，CDI)，同時(shí)其產(chǎn)芽孢的特性可造成CD在醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)的廣泛傳播。從2013年開始，CD就被被美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)列為最緊迫的公共衛(wèi)生威脅，每年給美國(guó)醫(yī)療保健系統(tǒng)造成10億美元的損失。至2019年美國(guó)CDC仍將其納入五大抗生素耐藥性緊急威脅之一。

當(dāng)前臨床上推薦治療CDI的抗菌藥物有甲硝唑(metronidazole，MTZ)、萬(wàn)古霉素(vancomycin)
和非達(dá)霉素(fidaxomicin)。除此之外，有研究表明替加環(huán)素(tigecycline)可有效治療重度CDI，利福昔明(rifaximin)可能有助于預(yù)防CDI復(fù)發(fā)。然而，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)CD對(duì)這些藥物的敏感性較前下降。來(lái)自美國(guó)休斯頓的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示CDI患者糞便分離株中26%對(duì)萬(wàn)古霉素不敏感，29%對(duì)MTZ不敏感；而在肯尼亞內(nèi)羅畢進(jìn)行的另外一項(xiàng)研究顯示對(duì)二者不敏感的分離株比例可高達(dá)67%和85%。與此同時(shí)，這兩種藥物治療失敗的報(bào)道也并不少見(jiàn)。在國(guó)內(nèi)，艱難梭菌不屬于CARSS和CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)監(jiān)測(cè)病原菌范疇，但某些小規(guī)模流行病學(xué)研究仍然提示耐藥菌株的存在。Meta分析顯示2007~2013年間我國(guó)臨床來(lái)源艱難梭菌對(duì)利福平的耐藥率為18.3%，對(duì)四環(huán)素的耐藥率為46.8%，對(duì)甲硝唑和萬(wàn)古霉素則完全敏感。浙江杭州兩所三甲醫(yī)院2012~2015年間腹瀉患者糞便l來(lái)源的411株艱難梭中有15.6%對(duì)甲硝唑耐藥，36.3%對(duì)四環(huán)素耐藥，所有菌株均對(duì)萬(wàn)古霉素敏感，且產(chǎn)毒株的多重耐藥率(96.4%)遠(yuǎn)高于非產(chǎn)毒菌株(31.4%)。艱難梭菌對(duì)抗菌藥物耐藥機(jī)制是多種多樣的。

細(xì)菌對(duì)抗菌藥物主要的幾類耐藥機(jī)制在艱難梭菌中均比較常見(jiàn)。艱難梭菌可通過(guò)改變藥物結(jié)構(gòu)造成抗菌藥物失效：例如通過(guò)轉(zhuǎn)座子Tn4453a和Tn4453b上攜帶的catD編碼的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，對(duì)氯霉素伯羥基進(jìn)行乙?；揎棇?dǎo)致藥物失效無(wú)法與細(xì)菌50S核糖體亞基結(jié)合；此外某些CD菌株編碼D類β-內(nèi)酰胺酶可破壞β-內(nèi)酰胺環(huán)使頭孢菌素類藥物失去活性。艱難梭菌還可對(duì)抗菌藥物靶點(diǎn)進(jìn)行修飾：例如vanCd操縱子的表達(dá)可造成CD肽聚糖前體末端d-Ser修飾，使該位點(diǎn)與萬(wàn)古霉素的親和力降低。迄今為止，在CD臨床株RpoB利福平耐藥決定區(qū)(rifampin resistance determining region，RRDR)中也已發(fā)現(xiàn)十余種耐藥突變，可能阻礙利福霉素類藥物與靶點(diǎn)RpoB蛋白的結(jié)合。艱難梭菌編碼不同家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)抗菌藥物進(jìn)行主動(dòng)外排：例如CD中cdeA編碼的MATE家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與氟喹諾酮耐藥有關(guān)，而ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CprABC介導(dǎo)了CD對(duì)抗微生物肽的抗耐藥性。生物膜的形成同樣參與了艱難梭菌對(duì)藥物的耐受：亞抑菌濃度的萬(wàn)古霉素和甲硝唑可增強(qiáng)CD生物膜的形成，同時(shí)CD生物膜又可耐受更高濃度的甲硝唑(10~100mg/L)和萬(wàn)古霉素(20mg/L)。除此之外，一些既往未考慮的機(jī)制如可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥(推測(cè)編碼N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的萬(wàn)古霉素耐藥質(zhì)粒pX18-498，甲硝唑耐藥質(zhì)粒pCD-METRO等)，同樣可能在艱難梭菌AMR中發(fā)揮重要作用。
甲硝唑
MTZ是硝基咪唑類抗生素，自20世紀(jì)90年代末以來(lái)一直是治療輕中度CDI的首選藥物。然而，自從流行毒株NAP1/027出現(xiàn)后，許多國(guó)家陸續(xù)報(bào)道了對(duì)MTZ低水平耐藥和異質(zhì)性耐藥的菌株，近年來(lái)甚至分離到高水平耐藥株。對(duì)MTZ治療響應(yīng)降低的CDI病例報(bào)道也越來(lái)越多見(jiàn)。
MTZ是一種前體藥物，攝入菌體后，在胞內(nèi)經(jīng)厭氧菌特有的低氧化還原電位酶促反應(yīng)還原激活，雜環(huán)裂變后形成羥乙基肟酸和乙酰胺。MTZ的殺菌機(jī)制尚不明確，可能為活化反應(yīng)伴隨生成的硝基自由基對(duì)厭氧菌產(chǎn)生細(xì)菌毒性，造成細(xì)菌死亡。
CD對(duì)MTZ耐藥亦可能涉及多種機(jī)制，其一是藥物還原激活通路的改變。參與藥物氧化還原反應(yīng)的電子傳遞蛋白如丙酮酸黃多辛氧化還原酶PFOR等在該酶促反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，這類蛋白編碼基因的突變參與了耐藥形成。鐵離子作為組成PFOR等電子傳遞蛋白功能性
輔基(如含鐵硫簇)的重要元素，在MTZ還原激活途徑中發(fā)揮重要作用，因此鐵代謝/穩(wěn)態(tài)的變化也被認(rèn)為與CD對(duì)MTZ耐藥有關(guān)。
艱難梭菌對(duì)甲硝唑耐藥可能與甲硝唑的臨床療效下降有關(guān)。近期研究表明，艱難梭菌對(duì)MTZ MIC≥1μg/mL是基于MTZ的初始治療方案臨床治療失敗的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。來(lái)自美國(guó)與歐洲的兩個(gè)多中心隊(duì)列RCT研顯示甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)方案下CDI初始治療失敗率接近30%，且后續(xù)出現(xiàn)CDI復(fù)發(fā)的概率總體達(dá)到23%，兩項(xiàng)指標(biāo)均劣于萬(wàn)古霉素。因此近5年歐洲和美國(guó)指南中MTZ地位有所下降，僅推薦用于治療不能耐受或無(wú)法獲得萬(wàn)古霉素/非達(dá)霉素的輕中度CDI初次發(fā)作患者。
萬(wàn)古霉素
最常見(jiàn)的萬(wàn)古霉素耐藥機(jī)制是van基因介導(dǎo)的藥物靶點(diǎn)修飾，造成萬(wàn)古霉素與細(xì)胞壁親和力降低。van系列基因主要介導(dǎo)d-Lac或d-Ser兩種末端修飾。其中，d-Lac修飾(d-Ala-d-Lac)由vanA和vanB基因簇編碼，可造成高水平萬(wàn)古霉素抗性；d-Ser修飾(d-Ala-d-Ser)由vanC、vanE和vanG基因簇編碼，可造成低水平抗性。多藥外排泵是存在于細(xì)菌細(xì)胞膜中的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中一個(gè)主要家族是ATP結(jié)合盒(ATPbinding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，水解ATP供能，對(duì)簡(jiǎn)單離子或大分子的溶質(zhì)如抗菌藥物進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)外排。已有研究在幾種梭狀芽孢桿菌中證實(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是造成多藥耐藥的主要原因。在CD中，陽(yáng)離子抗菌肽(cathelicidin antimicrobial peptide，CAMP)可誘導(dǎo)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白操縱子高表達(dá)，從而降低各種CAMP的有效性。
非達(dá)霉素
窄譜抗菌藥物非達(dá)霉素與細(xì)菌RNA聚合酶(RNA polymerase，RNAP)的夾型結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制DNA轉(zhuǎn)錄的起始步驟。自2011年起，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)非達(dá)霉素用于CDI。
非達(dá)霉素耐藥性源于RNAP結(jié)合位點(diǎn)的突變，包括RpoB (Gln1074Lys，Val1143Asp、Gly、Phe)和 RpoC(Gln781Arg，Asp1127Glu，Asp237Tyr)等多種突變。其中，Val1143Asp (MIC>64 mg/L) 和Val1143Gly (MIC=16 mg/L)也存在于非達(dá)霉素耐藥的臨床分離CD菌株中。RpoB的 Val1143Asp突變會(huì)影響CD的適應(yīng)性和毒力。Val1143Asp、Val1143Gly 突變的實(shí)驗(yàn)室菌株與其親本菌株R20291相比，整體生長(zhǎng)變緩、競(jìng)爭(zhēng)適應(yīng)性下降且毒素A和B的產(chǎn)生均減少，在 CDI金黃地鼠模型中其毒力也降低。
由于這類耐藥突變伴隨著適應(yīng)性降低，且非達(dá)霉素的窄譜活性對(duì)腸道微生物群影響較小，因此如果在治療過(guò)程中出現(xiàn)耐藥突變，共生的多種腸道微生物群可能有助于減輕突變帶來(lái)的影響。
利福昔明和四環(huán)素類
利福昔明抑制細(xì)菌RNA聚合酶。細(xì)菌RNA聚合酶β亞基RpoB突變是產(chǎn)生利福霉素抗性的主要機(jī)制。這些突變會(huì)破壞利福霉素和RpoB的直接相互作用或改變RpoB上的利福霉素結(jié)合口袋(rifamycin-binding pocket)結(jié)構(gòu)。
已發(fā)現(xiàn)CD中存在多處可造成耐藥的RpoB突變，包括Ser488Tyr，Asp492Tyr，His502Asn/Tyr，Arg505Lys，Ser550Phe/Tyr。與其他菌株不同(例如腦膜炎奈瑟球菌和結(jié)核分枝桿菌)，RpoB突變導(dǎo)致CD對(duì)利福霉素產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)不會(huì)產(chǎn)生體外和體內(nèi)適應(yīng)性代價(jià)。CD對(duì)利福霉素的耐藥性發(fā)展迅速，有研究顯示甚至在利福昔明用于CDI期間就可能出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致臨床效果不佳。
四環(huán)素類是靶向細(xì)菌30S核糖體的廣譜抗菌藥物，可阻止氨基酰-tRNA與mRNA結(jié)合從而抑制蛋白質(zhì)翻譯。與利福昔明相比，CD對(duì)替加環(huán)素的耐藥率較低。CD通過(guò)轉(zhuǎn)座子(例如Tn916、Tn5397和Tn4453)攜帶的各種tet基因(例如tetM、tetW、tetA(P)和tetB(P))編碼的核糖體保護(hù)蛋白即延伸因子(elongationfactor)，介導(dǎo)四環(huán)素類藥物耐藥性的產(chǎn)生。

隨著對(duì)耐藥性變遷和耐藥機(jī)制的更好了解，將為抗菌藥物合理應(yīng)用，遏制耐藥菌的產(chǎn)生和播散、新抗菌藥以及新耐藥菌快速檢測(cè)試劑盒的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
 

1. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet, 2022, 399(10325): 629–655.
2. Khoruts A, Staley C, Sadowsky MJ. Faecal microbiota transplantation for clostridioides difficile: mechanisms and pharmacology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2021, 18(1): 67–80.
3. Boekhoud IM, Sidorov I, Nooij S, Harmanus C, Bos-Sanders IMJG, Viprey V, Spittal W, Clark E, Davies K, Freeman J, Kuijper EJ, Smits WK, COMBACTE-CDI Consortium. Haem is crucial for medium-dependent metronidazole resistance in clinical isolates of Clostridioides difficile. J Antimicrob Chemother, 2021, 76(7): 1731–1740.
4. Zhao HL, Nickle DC, Zeng Z, Law PYT, Wilcox MH, Chen L, Peng Y, Meng J, Deng ZQ, Albright A, Zhong HZ, Xu X, Zhu SD, Shen JD, Blanchard RL, Dorr MB, Shaw PM, Li JH. Global landscape of clostridioides difficile phylogeography, antibiotic susceptibility, and toxin polymorphisms by post-hoc whole-genome sequencing from the MODIFY I/II studies. Infect Dis Ther, 2021, 10(2): 853–870.