假如世界上真的有唐僧肉，

我絕對想當妖精。

然而人類長生不老的問題一直懸而未決，

所以，

我們才會總是問活著的意義。

為了避諱，

生物學上的“死亡”，

不同的社會學說法就有兩百多種。

還有一種叫做“凋亡”，

是生物體組成基本單位——細胞

的消失方式之一，

它完美地詮釋了

一種從容不迫的態(tài)度。

 

那么，

什么是凋亡呢？

↓

細胞凋亡（Apoptosis）,又稱程序性細胞死亡（Programmed Cell Death，PCD），是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命，有一系列酶參與、由基因控制的一個主動的、高度有序的、非炎癥性細胞死亡的過程。近年來已在很多領(lǐng)域如胚胎學、內(nèi)分泌學、免疫學，尤其是腫瘤學方面引起廣泛的興趣和關(guān)注，其研究可能有助于闡明腫瘤發(fā)病機理并為其治療提供嶄新的途徑。

 

細胞凋亡不同于細胞壞死：

細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別

壞死（necrosis）是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程，表現(xiàn)為細胞脹大、胞膜破裂、細胞內(nèi)容物外溢、核變化較慢、DNA降解不充分和引起嚴重的局部炎癥反應(yīng)等。         

凋亡是細胞對環(huán)境的生理性或病理性刺激信號、環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過程，是一種基本的細胞生物學現(xiàn)象，在多細胞生物中起著去除不需要細胞或異常細胞的作用。表現(xiàn)為細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡期可見凋亡小體。貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落等現(xiàn)象。     

 

 

原來如此~

那么小編不禁想問，

怎么才能知道一個細胞是否凋亡呢？

別擔心，

人類有很多種檢測細胞凋亡的方法，

下面主要介紹兩種：

 

細胞凋亡的檢測方法

 

最直觀的當然是“看”啦：

 

1

形態(tài)學觀察

光鏡下細胞凋亡最早變化有細胞體積縮小、細胞核固縮、染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)、核碎裂、細胞漿和細胞器密度增高，細胞膜皺折、卷曲、出泡、胞漿膜包裹細胞碎片“凋亡小體”，凋亡小體是細胞凋亡的特征性改變。

電鏡下可見在細胞凋亡的早期細胞核染色體發(fā)生邊集，在細胞核膜周邊聚集成新月體形，隨之染色體發(fā)生固縮、電子密度增強、核形不規(guī)整，核碎裂成碎片、細胞體積變小、胞漿濃縮、空泡增多，可見細胞膜丫生出泡現(xiàn)象；在凋亡晚期可見膜泡內(nèi)有較完整的細胞器和細胞核碎片的凋亡小體。

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凋亡小體的形成示意

 

除了宏觀上的定性觀察，

還有更精確的定量檢測。

↓

 

2

生化特征檢測

 

細胞凋亡最明顯的生化特征是Ca^{2 +} 、Mg²⁺ 依賴性內(nèi)源性核酸酶的激活將細胞核染色體從核小體間斷裂，形成由大約為180 - 200bp 或其多聚體組成的寡核苷酸片段。

 

DNA凝膠電泳法

DNA 凝膠電泳表現(xiàn)在：正?；罴毎?DNA電泳為一條區(qū)帶,細胞凋亡時核酸內(nèi)切酶將DNA 分解成規(guī)則的180-200bp的DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳中就呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜，而壞死呈彌漫的連續(xù)圖譜。DNA 電泳法的缺點是不能進行準確定量，只能進行半定量。其靈敏性較差，要求所測標本細胞數(shù)在10⁶  以上才能使電泳清晰。實驗流程如下：收集細胞（5×10⁶-10⁷個cell ）→ DNA 提?。ǚ勇确隆⒙确鲁樘幔?rarr;瓊脂糖凝膠電泳→結(jié)果分析。

 

TUNEL法

TUNEL法（terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法)也稱DNA 斷裂的原位末端標記法，這一方法能對DNA分子斷裂缺口中的3'-OH進行原位標記，借助一種可觀測的標記物(如熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物)，能對凋亡細胞的核DNA中產(chǎn)生的3'-OH末端進行原位標記，用熒光顯微鏡即可進行觀察。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有 DNA 的斷裂，因而沒有 3'-OH 形成，很少能夠被染色。TUNEL 實際上是分子生物學與形態(tài)學相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應(yīng)細胞凋亡典型的生物化學和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態(tài)測定。

 

Annexin V法

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35~36kD 的Ca^{2 +}依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將 Annexin-V 進 行 熒 光 素（FITC、PE）標 記，以標記了的Annexin-V 作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidine iodide ，PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。實驗流程如下：收集細胞（5×10⁵~10⁶ ）→ 細胞染色（Annexin V，F(xiàn)ITC 凋亡檢測試劑盒）→流式細胞儀上機檢測→專業(yè)流式軟件結(jié)果分析（如flowjo ）。

 

Caspase-3活性檢測法

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32 kD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17 kD）和兩個小亞基（12 kD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞中，caspase-3的活性明顯下降。實驗流程：（以Western blot 分析為例）收集細胞→PBS洗滌→蛋白提取→蛋白定量→SDS-PAG電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉(zhuǎn)移→5%脫脂奶粉封閉→一抗孵育（Caspase-3多抗或單抗）→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗滌→二抗孵育→ TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗滌→ECL顯影或NBT/BCIP顯色→結(jié)果分析及判定。

 

幫人幫到底，送佛送到西。

除了告訴你怎么做，我們還會指點你怎么辦~

且看

 

常見問題

解決方案

 

1

如何選擇合適的凋亡檢測方法?

定性的研究方法可選DNA電泳法、形態(tài)學觀察（普通光學顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡）；定量或半定量的研究方法可選各種流式細胞儀方法、原位末端標記法等。DNA瓊脂糖凝膠電泳法敏感性不高，大量凋亡細胞同時存在時才出現(xiàn)典型的結(jié)果，且只能用于細胞群體，不能用于組織的原位檢測；TUNEL法可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用；細胞發(fā)生凋亡時，膜上的PS外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此Annexin V聯(lián)合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。并且Annexin V聯(lián)合PI染色不需固定細胞，可避免PI染色因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯(lián)合PI法更加省時，結(jié)果更為可靠，是目前最為理想的檢測細胞凋亡的方法。

 

 

2

Annexin V法通過流式細胞儀檢測細胞凋亡時

沒有凋亡信號/沒有早期凋亡信號？

沒有檢測到凋亡信號說明細胞未被染料標記上。不同公司生產(chǎn)的Annexin V、FITC細胞凋亡檢測試劑盒的生產(chǎn)工藝流程都不一樣。首先檢查試劑盒儲存是否正確（4度還是-20度）以及保質(zhì)期；其次檢查是否嚴格按照試劑盒所提供的實驗說明進行操作。

 

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3

Annexin V法通過流式細胞儀檢測細胞凋亡時

凋亡信號值過高？

在實驗操作過程中應(yīng)動作輕柔、迅速，避免影響細胞的活力及形態(tài)。在處理貼壁細胞時應(yīng)使用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，消化時間不宜太長，染色操作完成時應(yīng)盡快上機檢測。